蛋白定量

 

蛋白测定是在生命科学研究中最广泛应用的方法之一。在蛋白提纯，电泳，免疫分析，细胞生物，分子生物和其他研究应用时评估蛋白浓度是必需的。虽然目前有各种不同的蛋白测定方法，但仍然还没有一种测定方法被认为是广泛适合于所有的应用要求。每种方法都有它的优点和限制。一般来说，研究中经常需要用到一种以上的蛋白测定方法以排除一些未知的物质的干扰。

大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化，这一变化可由分光光度计或酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。博士德为大家提供两种蛋白测定手段，每种都有其独特的优点。如果样品数量较多，可以同时使用两种测定用酶标仪自动检测。当你选择一种蛋白测定方法时需要考虑两个因素：缓冲液的化学组成和检测的蛋白量。

Commassie法（Bradford法）：

原理：在酸性条件，蛋白质与考马斯染料G-250结合，颜色从棕色变为蓝色，在595nm处检测吸光值然后与标准曲线对比，即可计算出待测蛋白的浓度。

BCA法：

原理：在碱性条件下，蛋白将Cu++还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。

 

现对这两种方法进行比较：

 

一、实验材料：

细胞总蛋白提取试剂盒（AR0103）

M231

BCA蛋白定量试剂盒（AR0146）

Commassie改良增强型蛋白质定量试剂盒（AR0145）

 

二、操作步骤：

Commassie法：

     1.将BSA冻干标准品（10mg/支）用生理盐水或PBS稀释成2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml八个浓度的蛋白标准溶液。

     2.M231用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。

     3.各取20ul蛋白标准品和待测M231样品至相应标记的微孔板中。

     4.滴加200ul考马斯增强型试剂（溶液A）至每孔混匀并充分震荡30S

     5.停止震荡，在室温孵育样品10min

     6.在酶标仪中测量595nm时的吸光值。

     7.绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。

 

BCA法：

1.按50体积BCA试剂A加入1倍体积BCA试剂B配置适量BCA工作液，充分混匀。

      2.将BSA冻干标准品（10mg/支）用生理盐水或PBS稀释成2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml八个浓度的蛋白标准溶液。

      3.M231用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。

      4.各取20ul蛋白标准品和待测M231样品至相应标记的微孔板中。

      5.滴加200ulBCA工作液至每孔混匀并充分震荡30S

      6.停止震荡，在37度孵育样品30min

      7.在酶标仪中测量562nm时的吸光值。

      8.绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。

 

三、实验结果

 

 

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	样品1	样品2
Commsie法吸光值	0.530	0.522	0.431	0.262	0.118	0.041	0.001	0.000	0.000	0.722	0.401
BCA法吸光值	0.812	0.444	0.257	0.140	0.06	0.037	0.017	0.006	0.000	0.744	0.200

其中1到8为2000ug/ml，1000,500,250,125,62.5,31.25,15.625的标准浓度的BSA蛋白，9为空白孔，样品1为8倍稀释M231总蛋白，样品2为32倍稀释M231总蛋白

 

Commassie法：

 

为了测试准确，应在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。 由标准曲线可以算出样品原始浓度为14.4mg/ml

Commassie法优点是：

1.灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1ug。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

2.测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。

3.干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：

1.由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

2. 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1M的NaOH。（如同0.1M的酸干扰Lowary法一样）。

3. 标准曲线也有轻微的非线性，在0-1000ug/ml浓度范围内有较好线性。因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

 

BCA法：

由标准曲线可以算出样品原始浓度为14.28mg/ml

BCA法特点：    1. 灵敏度高，检测浓度下限达到25μg/ml，最小检测蛋白量达到0.5μg，待测样品体积为1-20μl 。    2. 测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80。    3. 在20-2000μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。    4. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。  5. 受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响：EDTA小于10mM。DTT小于1mM巯基乙醇低于1mM

 

BCA法和Commassie法各有优势，在不知道蛋白样本缓冲液成分的情况下可以两种方法配合使用，以消除定量的误差。